Desenvolvimento de sensor biomimético para detecção de resíduos de pesticidas organofosforados e carbamatos em alimentos

Enzimas têm sido empregadas na construção de dispositivos para quantificação de substratos por meio de reação catalítica. Tratando-se de moléculas de alto peso molecular e estrutura complexa, tais compostos biológicos podem apresentar instabilidade, além do alto custo de produção. Neste contexto, a utilização de um peptídeo artificial, proposto por estudos de modelagem molecular para mimetizar o sítio ativo da acetilcolinesterase (AChE), foi uma alternativa investigada para o desenvolvimento de metodologia analítica para detectar pesticidas organofosforados e carbamatos, que em sua maioria apresentam mutagenicidade, elevada toxicidade e são inibidores da AChE, essencial na transmissão de impulsos nervosos. O trabalho envolveu a síntese, purificação e caracterização de duas sequências peptídicas, SEQPEP1: NH3+-EHGGPS-COO- e SEQPEP2: NH3+-CEHGGPS-COO-, obtidas por meio de metodologia em fase sólida, que apresentaram índice de pureza acima de 95 %, possibilitando aplicação analítica. À sequência peptídica SEQPEP2, foi inserido o aminoácido cisteína com a finalidade de imobilizá-lo de forma ordenada na superfície de ouro. Os estudos espectrofotométricos demonstraram uma forte interação (K = 4,10 x 105 M-1) do peptídeo com o pesticida diclorvós e a formação de um complexo com absorção máxima em λ = 250 nm. Como suporte para a imobilização do peptídeo, foram utilizados eletrodos de ouro à base de discos compactos graváveis (CD-R) (Au-CDtrodos). As condições experimentais de imobilização do peptídeo foram otimizadas sendo os melhores resultados obtidos com uma concentração de peptídeo de 1 x 10-3 mol L-1 e um tempo de incubação de 1 h à 25 ºC. A estratégia de inserir cisteína para imobilizar o peptídeo indicou recobrimento de 68 % da superfície. Demonstrou-se pelos experimentos a viabilidade...Enzymes have been used in the construction of devices to quantify substrate by catalytic reaction. The disadvantages of biological materials as instability and high production cost are well known. Therefore, the design and development of artificial oligopeptides as a mimic of the acethylcholinesterase (AChE) binding site, preserving the highly selective biological properties, was the approach used in this study on the development of an analytical methodology for the detection of organophosphate and carbamate pesticides, because of their mutagenicity, high toxicity and the inhibition of acetylcholinesterase enzyme, which is essential for the transmission of nerve impulses. This work have involved the synthesis, purification and characterization of two peptide sequences, SEQPEP1: NH3+-EHGGPS-COO- and SEQPEP2: NH3+-CEHGGPS-COO-, obtained by solid phase methodology, which have presented a purity degree above 95 %, enabling the analytical application. A cysteine amino acid was added to the peptide sequence SEQPEP2 in order to self assembly it on the gold electrode surface. The spectrophotometric studies have demonstrated a strong interaction (K = 4.10 x 105 M-1) between the peptide and pesticide dichlorvos, and the formation of a complex with absorption maximum at λ = 250 nm. As a support for the immobilization of peptide, were used gold electrodes based on recordable compact discs (CD-R) (Au-CDtrodes). The experimental conditions for the immobilization of the peptide sequence were optimized, being the best results achieved by using a peptide concentration of 1 x 10-3 mol L-1 and an incubation time of 1 h at 25 ºC. The strategy to add a cysteine amino acid for the immobilization of the peptide has indicated a surface recovery of 68 %. The experiments have shown the viability of monitoring the interaction... (Complete abstract click electronic access below)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Construction and application of paper-based analytical devices in the detection of biomarkers for clinical diagnosis

Orientadores: Lauro Tatsuo Kubota, Scott T. PhillipsTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: A crescente demanda por dispositivos de diagnóstico rápidos, altamente sensíveis e de baixo custo tem estimulado esforços para a geração de sistemas analíticos simplificados, capazes de serem aplicados em campo. Este trabalho científico envolveu o estudo de diferentes abordagens para possibilitar a detecção qualitativa e quantitativa de biomarcadores para diagnóstico clínico em plataformas à base de papel. A primeira estratégia consistiu no entendimento dos princípios de funcionamento do dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral, permitindo avaliar as etapas críticas e consequentemente proporcionar as condições experimentais mais adequadas para o diagnóstico precoce da malária causada por Plasmodium falciparum, pela identificação do biomarcador HRP2. O melhor desempenho do dispositivo foi atingido por meio da utilização de 0,05 µg (1 µL / 50 µg mL-1) do anticorpo de captura e incubação por 5 minutos para sua adsorção; bloqueio da nitrocelulose com BSA 1,5% (m/v) contendo 0,1% do surfactante Tween-20 (v/v) por imersão e incubação por 10 minutos; 0,04 µg (20 µL/ 2 µg mL-1) de anticorpo de detecção conjugado com a enzima peroxidase; lavagem com solução tampão Tris-HCl 0,01 mol L-1 pH 7,4 contendo 0,15 mol L-1 de NaCl e 0,1% de Tween 20 (v/v); adição de 5 µL do substrato cromogênico TMB e realização da leitura no intervalo de 5-20 minutos após esta adição. O sistema com detecção colorimétrica apresentou um limite de detecção visual de 5 ng mL-1 (135 pmol L-1), cujo valor deve ser suficiente para identificar a contaminação pela malária no primeiro dia do aparecimento dos sintomas. A plataforma desenvolvida foi então aplicada para amostras de sangue de pacientes infectados pela doença, demonstrando eficiência na discriminação qualitativa de um resultado positivo e negativo e a geração de resultados confiáveis. Em outro estudo, com o intuito de proporcionar uma segunda geração do dispositivo, foi construído um sistema de detecção em 3D à base de papel capaz de ser acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral. Este sistema possibilita o diagnóstico de maneira quantitativa, automatizada e com amplificação de sinal por meio da incorporação de um novo material polimérico da classe dos poli(benzil éteres) que responde seletivamente a peróxido de hidrogênio, além de necessitar apenas da visualização de cor e de um cronômetro para a obtenção dos dados e posterior análise dos resultados. A delimitação das barreiras hidrofóbicas no papel foi realizada por meio de impressão à cera e foram avaliados os processos de orientação e tipo de papel a ser empregado na camada contendo o polímero. O processo de deposição do material na superfície do papel demonstrou uma maior repetibilidade quando realizada de forma automática por meio de um robô de manuseamento de líquidos. A condição de maior sensibilidade para o sistema de detecção em 3D foi atingida empregando uma concentração de polímero de 4,0 mg mL-1 com a obtenção de um limite de detecção de 0,02 mmol L-1 de peróxido de hidrogênio. Este sistema foi então acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral e utilizado em estudos iniciais na detecção da isoenzima MB da creatina quinase, um dos biomarcadores indicado para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdioAbstract: The growing demand for rapid, highly sensitive and cost effective diagnostic devices has stimulated considerable efforts towards the generation of simplified analytical systems capable of being applied in the field. This scientific work involved different approaches for the qualitative and quantitative detection of biomarkers for clinical diagnosis on paper-based analytical platforms. The first strategy consisted of understanding the principles behind the lateral flow immunoassay, in order to evaluate the critical steps and consequently to provide the most adequate experimental conditions for the early diagnosis of Plasmodium falciparum malaria by the identification of the HRP2 biomarker. The best performance of the device was achieved by using 0.05 µg (1 µL / 50 µg mL-1) of capture antibody and incubating for 5 minutes in order for it to adsorb; blocking the nitrocellulose with 1.5% (w/v) BSA containing 0.1% (v/v) surfactant Tween 20 by immersion and incubation for 10 minutes; 0.04 µg (20 µL/ 2 µg mL-1) of detection antibody labeled with the peroxidase enzyme; washing with 0.01 mol L-1 Tris-HCl buffer solution pH 7.4 containing 0.15 mol L-1 NaCl and 0.1% (v/v) Tween 20; addition of 5 µL of the chromogenic substrate TMB followed by reading in the range of 5-20 minutes after this addition. The colorimetric detection system presented a visual limit of detection of 5 ng mL-1 (135 pmol L-1), a value that should be enough for identifying the contamination by malaria in the first day of the appearance of the symptoms. The developed platform was then applied to blood samples from patients infected by the disease, demonstrating efficient performance at qualitatively discriminating a positive and a negative result, thus producing reliable results. In another study, aiming to provide a second generation of the device, a 3D paper-based detection system capable of being coupled to a lateral flow immunoassay platform was constructed. This system enables the obtainment of a quantitative and automated diagnostic assay with signal amplification by employing a new polymeric material from the class of poly(benzyl ethers) that selectively responds to hydrogen peroxide, besides requiring only the color visualization and a timer to obtain the data for subsequent analysis of the results. The delimitation of the hydrophobic barriers on the paper was carried out by wax printing and the orientation and type of paper to be employed in the layer containing the polymer were evaluated. The process of depositing the material on the surface of the paper demonstrated great repeatability when performed automatically by using a liquid handling robot. The highest sensitivity condition for the 3D detection system was achieved by employing 4.0 mg mL-1 of polymer, which allowed obtaining a limit of detection of 0.02 mmol L-1 of hydrogen peroxide. This system was then coupled to a lateral flow platform and employed in initial studies for the detection of creatine kinase MB isoenzyme, one of the biomarkers indicated for the diagnosis of acute myocardial infarctionDoutoradoQuimica AnaliticaDoutor em Ciências2013/09171-2, 2014/18190-3140736/2013-1FAPESPCNP

A simple, sensitive and reduced cost paper-based device with low quantity of chemicals for the early diagnosis of plasmodium falciparum malaria using an enzyme-based colorimetric assay

FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOIn this study, we report the development of a paper-based platform with low amount of reagents for the detection of the histidine-rich protein 2 by an enzyme-based colorimetric assay aiming for the early diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. A CO2 l255221132120FAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICOFAPESP - FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULOCNPQ - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO2008/57805-22013/09171-2sem informaçãoThe authors thank São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Proc. n°. 2008/57805-2, 2013/09171-2), National Institute of Science and Technology in Bioanalytics (INCTBio) and National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) for the finan

Amperometric Immunosensor for Chagas' Disease Using Gold CD-R Transducer

Chagas' disease has been spread mainly through blood transfusion or blood components, therefore the development of a device for neglected diseases with high specificity and sensitivity is important to public health. This work describes the development of an amperometric immunosensor for determination of Chagas' disease through a gold-based electrode obtained from a recordable compact disc modified with 4-(methylmercapto) benzaldehyde for the immobilization of Tc85 protein of the Trypanosoma cruzi. The immunoassays were carried out using positive and negative sera from Chagas' disease patients and immunoglobulin conjugated with peroxidase enzyme. The immunosensor presented -0.949 mu A as cut-off value and was applied in sera samples.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Using SPE-LC-ESI-MS/MS analysis to assess disperse dyes in environmental water samples

We have optimized an SPE-LC-ESI-MS/MS method and used it to monitor disperse azo dyes in environmental aquatic samples. Calibration curves constructed for nine disperse dyes-Red 1, Violet 93, Blue 373, Orange 1, Orange 3, Orange 25, Yellow 3, Yellow 7 and Red 13-in aqueous solution presented good linearity between 2.0 and 100.0 ng mL(-1). The method provided limits of detection and quantification around 2.0 and 8.0 ng L(-1), respectively. For dyes at concentrations of 25.0 ng mL(-1), the intra- and interday analyses afforded relative standard deviation lower than 6 and 13%, respectively. The recovery values obtained for each target analyte in Milli-Q water, receiving waters and treated water samples spiked with the nine studied dyes at concentrations of 8.0, 25.0 and 50.0 ng L(-1) (n = 3) gave average recoveries greater than 70%, with RSD <20%. Statistical evaluation aided method validation. The validated method proved to be useful for analysis of organic extracts from effluents and receiving water samples after an SPE extraction step. More specifically, the method enabled detection of the dyes Disperse Red 1, Disperse Blue 373 and Disperse Violet 93 at concentrations ranging from 84 to 3452 ng L(-1) in the treated effluent (TE), affluent and points collected upstream and downstream of the drinking water treatment plant of a textile dye industry in Brazil